加樣、溫育和洗板操作不當(dāng)尤其影響ELISA測定結(jié)果

ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。慧穎生物。

    加血清樣本及反應(yīng)試劑：

    在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是惟一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是，加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孑L之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。慧穎生物。

    溫育：

    溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。zui為常用的溫育溫度有37~C和室溫，其次是43~C和2～8~C。慧穎生物。

    溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現(xiàn)問題的步驟。目前國內(nèi)通常ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 0．5～lh，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2h。一般來說抗原抗體反應(yīng)在37℃下需要1～2h才能有較*的結(jié)合，低于1h，可能會影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：

    1．要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間  一般來說，加完樣本和（或）反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長，而在臨床實(shí)驗(yàn)室中，很少有天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測量觀察即可。慧穎生物。

    2．溫育溫度的選擇  在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1h，另一種則為43℃下45min。從免疫測定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反應(yīng)較長的時(shí)間zui為*，如2—8℃下反應(yīng)24h。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動的加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對分子含量較多的強(qiáng)陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應(yīng)時(shí)間的條件。慧穎生物。

    3．“邊緣效應(yīng)”的排除  以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板外周孑L與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同。但有研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。慧穎生物。

總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆募啿挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈校庞跍叵渲校@樣就會因?yàn)榘鍡l孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。慧穎生物。

    洗板：

    固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成分分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0．05％山梨醇—20的中性PBS，山梨醇—20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其在洗滌中的作用機(jī)制是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中山梨醇—20濃度高于0．2％，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測定下限。慧穎生物。

    在實(shí)驗(yàn)室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。手工洗板進(jìn)行下一步測定操作。洗板機(jī)洗板則是將上述手工操作改由洗板機(jī)進(jìn)行，使用洗板機(jī)洗板的一個(gè)特點(diǎn)是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機(jī)洗板至*所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機(jī)。在特定臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的洗板機(jī)，到底洗多少次能達(dá)到要求，可進(jìn)行下面這個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)：選擇4X8 HBsAgELISA包被板條，每2X8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結(jié)合物并完成溫育后，洗板孔時(shí)按第1排4孔洗1次、第2排4孔洗2次、第3排4孔洗3次……直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次后，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性／陰性值保持zui大不變，則可以認(rèn)定該實(shí)驗(yàn)室所用洗板機(jī)3次洗板即可達(dá)到要求。慧穎生物。