人心型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)酶聯免疫分析試劑盒

使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中心型脂肪酸結合蛋白(h-FABP)含量。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗  h-FABP抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗  h-FABP抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物  TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 h-FABP呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）： 2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為150 ng/ml，請先稀釋至30 ng/ml，再做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)后，分別稀釋成30 ng/ml，15 ng/ml，7.5 ng/ml，3.75 ng/ml，1.88 ng/ml，0.94 ng/ml，0.47 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制15 ng/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 30 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔），實際配制時應多配制  0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份

自備物品

1.   酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預熱）

2.   微量加液器及吸頭，EP管

3.   蒸餾水或去離子水，全新濾紙

標本的采集及保存

1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過1個月，-80℃不應超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試  劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加  檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。

注：

1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在  10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶 標儀讀數。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。

7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

    如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。

2.  自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人h-FABP，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為縱坐標（對數坐標）， OD值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.312 ng/ml-20 ng/ml

靈敏度：0.078 ng/ml