細胞凋亡檢測方法

　　 細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細胞凋亡的形態學檢測

　　根據凋亡細胞固有的形態特征，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
　　 1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
　　 （1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
　　 （2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。
　　 2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
　　 一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
　　 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與　DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
　　 Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
　　 DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
　　 結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。

3 透射電子顯微鏡觀察
　　 結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
　　 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

方法
　　 1 懸浮細胞的染色：將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
　　 2 貼壁培養的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。
　　 3 爬片細胞染色：同上，zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。

　注意事項
　　 1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。
　　 2. 操作時注意避光，反應完畢后盡快在一小時內檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測

　　線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中zui早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
　　 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。
　　 方法：將正常培養的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
　　 注意事項
　　 1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。
　　 2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA檢測

　　細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
　　 1. 大分子染色體DNA測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。
　　 參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
　　 2． DNA Ladder 測定
　　 方法：收獲細胞（1X107）沉淀?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C一夜?14000rpm′15min?zui后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。

3． 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
　　 方法：收集細胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定置夜，PBS洗滌，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法

　　細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
六、Caspase-3活性的檢測

　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，zui終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
　　 1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
　　 方法：
　　 收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C置夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C置夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

2 熒光分光光度計分析
　　 原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
　　 方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS洗滌，制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。

3 流式細胞術分析
　　 方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
　　 （一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
　　 材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
　　 儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
　　 方法：
　　 1 懸浮細胞的染色：
　　 （1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　 （4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。
　　 （5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應30min
　　 （6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm 10min。
結果觀察：將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。

2：貼壁細胞的原位染色
　　 （1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
　　 （2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
　　 （3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。

3：臨床病理切片的染色、檢測。
　　 4：原代細胞的培養、檢測。
　　 5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
　　 （二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
　　 1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
　　 材料和試劑：
　　 1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
　　 2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　 3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）
　　 4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
　　 5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
　　 6. 顯色液（現配現用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　 7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機
　　 操作步驟
　　 1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C置夜（一般24h以上）。
　　 2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
置夜。
　　 3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
　　 4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
　　 5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
　　 6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
　　 7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
　　 8. Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。