葡聚糖凝膠層析

【實驗目的】

1.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。

2．學習葡聚糖凝膠層析的基本操作技術。

【實驗原理】

凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質的分子量差異為基礎的一種層析分離技術，這一技術為純化蛋白質等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。

    葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結構的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結構越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結構就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。

    葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質通過柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質*被凝膠排阻，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質可*進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而zui后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于*排阻和*進入網(wǎng)孔物質的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達到分離目的。

    本實驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分離藍色葡聚糖—2000和溴酚藍。藍色葡聚糖—2000分子量接近2×10⁶， 而溴酚藍分子量為670，二者分子量相差較大，前者*排阻，而后者則可*進入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時間不同而分開。

【實驗材料】

1.實驗器材

層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計

2.實驗試劑

   (1) Tris—醋酸緩沖液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。

   (2) 溴酚藍溶液：稱取溴酚藍10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分攪拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍色。

   (3) 藍色葡聚糖—2000溶液：稱取藍色葡聚糖—2000  10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。

   (4) 樣品溶液：取溴酚藍溶液0.1毫升，藍色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。

   (5)葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex-G-25)

【實驗操作】

1.實驗凝膠的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時需經(jīng)溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹 2小時，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，用蒸餾水反復洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次，使pH和離子強度達到平衡，zui后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。

    2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，zui后保留約2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達到8厘米,關閉出口。裝柱過程中嚴禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡l至2個柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。

3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關閉下端出口。取溴酚藍及藍色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液進入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液。當樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時，關閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應*進入凝膠柱內(nèi)后，再進行下一次洗滌。zui后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為3—4cm。

    4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升，進行洗脫。仔細觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管(試管預先編號)，收集約20管左右，樣品即可*被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計在波長540nm處測定其光密度。

    5.凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。

 2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強，zui后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。
   3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。
看完第2點后，就應該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得zui多的是反相溶劑洗脫，以甲醇--水系統(tǒng)zui為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，zui后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿--甲醇zui為常見，先用50％氯仿--甲醇，逐漸增加甲醇比例，zui后用100％甲醇沖柱。
   4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇--水），樣品用zui少體積的甲醇--水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿--甲醇），樣品用zui少體積的氯仿--甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。
   5 Sephadex LH-20的步驟。
(1) 選擇條件：
梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。
(2) 飽和層析柱：
用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。
(3) 樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。
(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。
(5) 洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。
再生以備下次使用。
   6 分離的技巧，zui后說說我的使用心得
（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。
（2）柱子盡可能長， Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力，打擊敵人。
（3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20 個保留體積接成一餾分。
（4） 洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個保留體積。
（5）鞣質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質
（6）Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果，方法很成型，有大量文獻參考。
（7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。

   Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同時適用于分子類別非常相似的物質的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于zui終精制步驟，如非對映同分異構體的分離。
   1.裝柱
裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（zui高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進行*的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠粒可移動。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。
    2.平衡
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇撟⒁饽z在新溶劑中的溶脹性質，并根據(jù)性質確定柱高調(diào)節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。
    3.洗脫液
為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質。
    4.樣品
樣品體積應該占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。
    5.洗脫
洗脫流速應根據(jù)情況而定，zui大線性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h。總體來說，較低的流速，具有較高的分辯率。