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封閉

在轉膜之后，也就是抗體孵育之前，需要對膜進行封閉。封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。常用的封閉液有BSA，脫脂奶粉，血清等，一般用的是脫脂奶粉。脫脂奶粉有些特殊情況是不適用的 ，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用；不能用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測；不能用于堿性磷酸酶（AP）顯示方法。

抗體孵育——WB真正的難點：抗體的使用是一種藝術，一種抗體一個脾氣。

對WB結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。 無論你如何提高自己的轉膜技術，和低效之間往往只有數倍的差異， 而抗體的效價可以差數千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價 不被過分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的zui大化。

一抗：*抗體能和非抗體性抗原特異性結合的蛋白，包括單克隆抗體和多克隆抗體；二抗：第二抗體能和一抗結合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測抗體的存在，放大一抗的信號。一般二抗都會偶聯可以檢測的標記（如熒光、放射性、化學發光或顯色基團），用來檢測一抗；如果一抗本身偶聯有這些標記，則不需要二抗，就是所謂的直接WB。

那么如何正確的來選擇二抗呢？*根據一抗的種屬來源選擇二抗；第二根據一抗的類型選擇二抗，根據單體數量和重鏈分類，將抗體分為IgA，IgD，IgE，IgG，IgM五類。其中又可分為幾個亞型：IgA1-2，IgG1a，2a，2b，3，IgM1-2。

顯色

酶促反應可以搭配不同的底物從而實現不同的顯色方法：化學發光Chemiluminescent 和底物顯色Colormetirc/Chromogen，前者靈敏度很高——隨著各大廠家努力開發研制靈敏度更高的發光底物，化學發光法的靈敏度已經達到pg別，甚至還有 Femto級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。zui為大家熟悉當數辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，屬于過氧化物酶POD類）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常見問題分析：

1.曝光后背景過高且不均勻

封閉不充分：延長封閉時間，更換合適的封閉劑；一抗濃度過高：增加一抗稀釋倍數；抗體孵育溫度過高：4℃孵育；二抗非特異性結合或與封閉劑交叉反應：設置二抗對照（不加一抗），降低二抗濃度。

洗膜不充分：增加洗膜次數

2.沒有陽性條帶或很弱

一抗、二抗不匹配：訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或底物與酶系統之間相匹配的抗體及底物，可通過設置內參驗證二級系統的有效性； 更換更好的抗體；一抗，二抗濃度低：增加抗體濃度，延長孵育時間封閉劑與一抗有交叉反應：封閉時使用溫和的去污劑，更換封閉劑樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過少，設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加樣本上樣量；轉膜不充分還洗膜過度：使用麗春紅S檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透，正確的轉膜操作，勿過度洗膜；曝光時間過短：延長曝光時間，更換更靈敏的發光液

3.背景有白色/黑色斑

轉膜時有氣泡或抗體分布不均：盡量除去氣泡，抗體孵育時保持搖動；封閉劑溶解不充分有顆粒狀

hBMECs細胞*人腦微血管內皮細胞凍存：

１．將細胞消化下來，移入離心管離心，棄上清

２．準備凍存液比例：５０％ＦＢＳ＋４０％培養基＋１０％ＤＭＳＯ（現用現配）

３．加１．５凍存液在離心管中，將細胞吹打均勻，移入凍存管內．

放入－２０度冰箱２－４小時后．再放入－８０度冰箱過ye，第二天放入液氮罐保存.

hBMECs細胞*人腦微血管內皮細胞常見的污染如下：

1、細菌：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染細菌的不同，可有不同的外形，培養液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。

2、霉菌：培養液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質，37度孵箱培養2-3天，仍清亮，但出現絮狀雜質，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但時間長之后，細胞的活力狀態變差，

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。

3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養液一般培養液一般會渾濁，原體感染，國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是慢慢凋亡。

4、黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。

5、真菌：一般培養液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發現，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。

6、原蟲：培養液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的，但他們的數量小，細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，zui終形成惡性循環。

hBMECs細胞*人腦微血管內皮細胞運輸：凍存的細胞干冰運輸，復蘇的細胞冰袋運輸。冬季我們會選擇全血清包被細胞株運輸，運輸途中細胞處于休眠狀態，避免天氣過冷導致的細胞死亡。