C17.2細(xì)胞株復(fù)蘇失敗原因分析

產(chǎn)品名稱：C17.2細(xì)胞

中文名稱：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞

種屬：小鼠

來源：神經(jīng)干細(xì)胞；C57BL/6 x CD-1

培養(yǎng)條件：EMEM

生長狀態(tài)：貼壁

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C17.2細(xì)胞株復(fù)蘇失敗原因分析

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

一、細(xì)胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養(yǎng)基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。C17.2細(xì)胞株復(fù)蘇失敗原因分析

SW1990   人胰腺癌細(xì)胞         人     胰腺癌；男性         L15   貼壁

RPMI8226        人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞     人     骨髓瘤；男性         1640         懸浮

HMrSV5   人腹膜間皮細(xì)胞     人     腹膜間皮細(xì)胞         1640         貼壁

MEG-01   人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞     人     慢性髓細(xì)胞性白血病；男性         1640         懸浮

CCD-18Co         正常人結(jié)腸成纖維細(xì)胞         人     結(jié)腸；成纖維細(xì)胞；女性     EMEM      貼壁

KGN 人卵巢顆粒細(xì)胞     人     卵巢；顆粒細(xì)胞；女性         DMEM     貼壁

HCC70      人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞         人     乳腺導(dǎo)管癌；女性         DMEM     貼壁

C3A  人肝母細(xì)胞癌細(xì)胞         人     肝母細(xì)胞癌；男性         IMDM      貼壁

QBC939   人膽管癌細(xì)胞         人     膽管癌     1640         貼壁

Leydig       豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞     豬     睪丸；間質(zhì)細(xì)胞     DMEM     貼壁

BPH-1       人前列腺增生細(xì)胞         人     良性前列腺增生；男性         1640         貼壁

WML2      小鼠肺成纖維細(xì)胞         小鼠         肺；成纖維細(xì)胞     DMEM     貼壁

Hs578Bst          人正常乳腺細(xì)胞     人     乳腺細(xì)胞         1640         貼壁

HCASMC  人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞         人     冠狀動(dòng)脈平滑肌     DMEM     貼壁

HSC-3       人口腔鱗癌細(xì)胞     人     舌鱗癌；男性         EMEM      貼壁

CA9-22     人口腔上皮癌細(xì)胞         人     牙齦鱗癌；男性     DMEM     貼壁

MHCC97H        人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞     人     肝癌；高轉(zhuǎn)移；男性     EMEM      貼壁

SSP-25      人肝膽管癌細(xì)胞     人     肝內(nèi)膽管癌；女性         DMEM     貼壁

JeKo-1      人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞     人     套細(xì)胞淋巴瘤；女性     1640         懸浮

MCF-10A 人正常乳腺上皮細(xì)胞     人     乳腺；上皮細(xì)胞；自發(fā)永生；男性     1640         貼壁

BeWo        人胎盤絨毛癌細(xì)胞         人     妊娠性絨癌     EMEM      貼壁

MOVAS     小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞         小鼠         主動(dòng)脈平滑肌；SV40轉(zhuǎn)化；C57BL/6  DMEM     貼壁

MA-104    猴胎腎細(xì)胞     猴     胚腎；自發(fā)永生     DMEM     貼壁

LAD2         人肥大細(xì)胞     人     肥大細(xì)胞         1640         懸浮

HMC-1     人肥大細(xì)胞     人     肥大細(xì)胞         IMDM      懸浮

NCI-H1299       人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞     人     大細(xì)胞肺癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；男性         1640         貼壁

IPEC-J2     豬小腸上皮細(xì)胞     豬     小腸；上皮細(xì)胞；自發(fā)永生         1640         貼壁

MARC-145        猴胚胎腎上皮細(xì)胞         猴     胚腎；自發(fā)永生     DMEM     貼壁

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長培養(yǎng)基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細(xì)胞/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí)，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三、細(xì)胞的分化、衰老與死亡

1、細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細(xì)胞均來自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個(gè)過程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期。旺盛生長分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同。

2、細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：

成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細(xì)胞衰老過程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時(shí)，細(xì)胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。

細(xì)胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說”。

3、細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正常現(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死，稱為細(xì)胞的病理死亡，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

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